当期论文|浙江海洋水产研究所梅光明、赵月涵等:基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响

为研究大黄鱼（Larimichthys crocea）蛋白质在海水流化冰辅助保鲜期内的变化，采用串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）技术定量标记新鲜（贮藏0 d）大黄鱼及不同海水流化冰贮藏时间（7、23 d）下大黄鱼的肌肉蛋白质，筛选出不同贮藏时间下的差异表达蛋白，并对差异蛋白进行基因本体（gene ontology, GO）、直系同源簇/真核生物直系同源簇（clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups, COG/KOG）与京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析。结果显示，在3个比较组（7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d）中鉴定到的差异蛋白总数分别为215、133、269个，其中表达上调的差异蛋白数分别为117、37、113个，表达下调的差异蛋白数分别为98、96、156个。同时，3个比较组的共有差异蛋白为44个。GO分析表明，差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面；COG/KOG分析表明，差异蛋白的功能活性主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面；KEGG分析表明，差异蛋白共参与38条信号通路，且在贮藏后期（23 d），紧密连接和致病性大肠埃希菌感染2条信号通路中差异蛋白的参与数目最多，它们可能是造成大黄鱼新鲜度急剧下降的主要信号通路。44个共有差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标进行的相关性分析表明，脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白可以作为新鲜度指示蛋白。本研究为揭示大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质变化机制、大黄鱼新鲜度评价和保鲜工艺改进提供了依据。

流化冰;  大黄鱼;  串联质谱标签;  差异蛋白;  新鲜度指示蛋白

赵月涵, 梅光明, 张小军, 许丹, 郑斌, 邓尚贵. 基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2023, 49(4): 566-577 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211

ZHAO Yuehan, MEI Guangming, ZHANG Xiaojun, XU Dan, ZHENG Bin, DENG Shanggui. Tandem mass tag-based proteomics technology analyzing the effects of seawater slurry ice-assisted preservation on muscle proteins of Larimichthys crocea. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2023, 49(4): 566-577 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211

大黄鱼（Larimichthys crocea）属石首科黄鱼属，富含蛋白质、矿质营养元素和脂肪酸等营养物质，其产量近年来稳居海水养殖鱼前列。由于内源性酶和微生物的作用，大黄鱼极易腐败变质，保鲜期较短。目前市售大黄鱼多采用冰鲜或低温冻藏方式来延长保鲜期。冰鲜通常因采用粒径较大的冰颗粒或冰块，极易造成鱼体破坏，且存在保鲜温度过高、保鲜期过短的缺点。低温冻藏又会造成盐析效应、蛋白质冷冻变性及细胞结构遭冰晶破坏等情况，导致解冻后的大黄鱼品质急剧下降。因此，消费者普遍偏好食用冰鲜大黄鱼。流化冰为直径小于1 mm的微小冰晶与载液组成的固液两相匀浆状混合物，其载冷能力强、终温低且可控；对水产品的机械损伤小；具有隔绝空气、抑制微生物繁殖及脂质氧化的作用，能有效延长水产品货架期。因此，流化冰是水产品加工保鲜中极具潜力的绿色新型冷媒。本课题组前期采用微粒冰与海水（质量比为7∶3，温度为－2.2 ℃）制备的海水流化冰体系进行大黄鱼保鲜研究，发现较普通碎冰方式可以将大黄鱼保鲜期延长7～10 d。

目前主要采用感官评价和理化指标分析方法进行大黄鱼新鲜度检测，近年来也应用了近红外光谱等新型无损检测技术。这些技术研究通常都是从水产品腐败的节点入手来表征大黄鱼等鱼类的新鲜程度，较少涉及贮藏期内鱼类蛋白质分子变化及保鲜机制等方面。为进一步探究鱼类新鲜度变化的机制，基于质谱和蛋白质组学的新鲜度研究技术逐渐得到发展。有研究采用蛋白质组学基于高通量质谱分析对生物体内的肽段/蛋白质组成进行鉴定，并结合生物信息学手段与特定的数据库进行比对，以期研究机体内蛋白质水平上发生的变化。近年来，已有不少学者利用蛋白质组学研究大口黑鲈、中华管鞭虾、三文鱼和金枪鱼等水产品在贮藏期内的新鲜度及品质变化规律。串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）技术利用特异性化学标记实现对不同样本中的蛋白质同时进行定性和定量分析，具有高通量、高准确性和高分辨率等优点，在蛋白质组学研究中得到广泛应用。目前大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的蛋白质变化机制尚未见报道，本研究通过基于TMT的蛋白质组学分析技术筛选出大黄鱼在海水流化冰不同贮藏时间下的差异表达蛋白，通过基因本体（gene ontology, GO）分析、京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析、直系同源簇/真核生物直系同源簇（clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups, COG/KOG）功能分析以及差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标间的相关性分析，预测在海水流化冰贮藏期内大黄鱼的新鲜度指示蛋白，旨在揭示大黄鱼的品质变化机制，为评价大黄鱼新鲜度提供新方法，同时为大黄鱼保鲜工艺改进提供新思路。

本研究采用基于TMT的蛋白质组学技术研究了大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的蛋白质变化，鉴定了不同贮藏时间下的差异蛋白。GO分析表明，差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面；COG/KOG分析表明，其功能活动主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面；KEGG分析表明，差异蛋白共涉及38条信号通路。本研究筛选出的脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白5个肌肉蛋白质与大黄鱼海水流化冰贮藏期内的新鲜度指标显著相关，有望成为贮藏期内大黄鱼品质变化的指示蛋白。本研究可为全面深入分析大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质下降机制，进行大黄鱼新鲜度评价和控制提供新的思路和科学依据。