炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种特发性的免疫病变。IBD的主要表现为体质量减轻、带血腹泻、持续腹泻、腹痛。虽然IBD的具体发病机制尚不完全清楚，但通常认为平衡系统的破坏，包括氧化系统、免疫系统、肠道屏障和肠道菌群，是IBD发展的主要因素。正常情况下，位于肠道表面的肠上皮细胞可以阻止外来有害物质进入肠腔，维持肠道内稳态。氧化应激是体内氧化和抗氧化作用之间的不平衡状态，具有氧化倾向。氧化应激可导致高活性分子活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量产生。肠道中过量暴露于ROS会促进促炎因子的产生，导致肠道炎症。同时，氧化应激可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体，促进炎症，最终破坏结肠黏膜结构，诱发IBD。此外，肠道微生物在提高机体免疫力、修复肠道屏障、抑制肠道病原体等方面发挥着至关重要的作用。然而，肠道微生物群的失衡，如变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）比例增加，导致慢性炎症和代谢功能障碍，最终破坏肠道屏障。同时，微生物产生的短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）能够通过多种靶点影响肠道健康。因此，肠道微生物的变化和结肠黏膜的破坏在IBD的恶化中起着至关重要的作用。胞外多糖是微生物生长过程中分泌在细胞外的重要代谢物。胞外多糖（exopolysaccharides，EPSs）因其“被普遍认为是安全的”和多样化的功能特征而引起了很大关注。研究表明，EPSs参与肠道屏障的修复和肠道菌群的调节。这些发现表明，将EPSs作为一种新兴物质用于IBD治疗的可能性。双歧杆菌（Bifidobacterium）被认为是人体肠道中重要的益生菌，对肠道炎症的缓解作用已被临床和动物实验证实。其中，EPS分泌功能在双歧杆菌中也很常见。双歧杆菌分泌的EPSs也被认为是其益生菌作用机制的主要组成部分。例如，来自B. breve lw01的EPS通过调节细胞周期和促进细胞凋亡发挥抗癌作用。动物双歧杆菌的EPS通过减少凋亡和促进自噬泡形成来减轻大肠杆菌诱导的IPEC-2细胞损伤。来自于B. longum W11的EPS显著增加H2O2诱导的人肺成纤维细胞中的巯基，同时有效降低细胞内ROS的含量。有研究证实，高产EPS的B. breve H4-2通过降低肠道氧化应激水平，能够有效修复葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的结肠炎。然而，H4-2分泌的EPS在肠道氧化应激中的具体作用尚不清楚。因此，东北农业大学食品学院、乳品科学教育部重点实验室的Niu Mengmeng（第一作者）、孟祥晨（通信作者）等将H2O2诱导的IEC-6细胞损伤与DSS诱导的小鼠结肠炎相结合，揭示B.
breve H4-2分离的胞外多糖（exopolysaccharide from B. breve H4-2，BBE）在修复肠道屏障和调节肠道菌群中的潜在作用。基本成分分析表明，BBE的总碳水化合物含量为80.73%，蛋白质含量为4.31%，醛酸含量为2.07%，硫酸盐含量为3.37%。BBE主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖和半乳糖组成，物质的量比为1.00:0.76:1.79:1.03:0.63（图1A）。紫外-可见光谱（图1B）显示，BBE在280 nm处有1 个小的吸收峰，这表明BBE含有少量蛋白质，证实BBE结构中存在氨基糖。FTIR光谱分析显示了BBE的典型多糖特征吸收峰（图1C）。例如，3 396.74 cm－1处的吸附峰对应于强烈的羟基（O—H）拉伸振动。在2 933.10 cm－1处出现一个弱吸附带，这是由于C—H和C—O键的拉伸晃动所致。1 651.02 cm－1附近的峰值预示C＝O键的存在。此外，在1 562.54 cm－1处有1 个较弱的吸附带，与酰胺基团的拉伸振动一致，表明BBE中存在蛋白质。1 250.28 cm－1处的吸附带可能是由于S＝O拉伸振动而出现的，表明BBE中存在硫酸盐基团。1 056.96 cm－1处的吸附带被认为是C—O的拉伸振动。最后，872.14 cm－1处的小吸附带被认为是α-半乳糖拉伸振动的特征。采用紫外-可见分光光度仪测定含有0.15 mol/L NaOH的刚果红-BBE溶液的λmax，以加入0.15 mol/L NaOH的刚果红为阴性对照。与对照相比，BBE在486～499 nm范围内出现了明显的红移（图1D），表明BBE具有三链螺旋结构。如图1E所示，H2O2作用于IEC-6细胞2 h后，细胞活力从100%下降到21.64%，表明H2O2对IEC-6细胞具有剂量依赖性的毒性作用。当H2O2浓度超过200 μmol/L时，IEC-6细胞存活率未见明显下降。因此，选用H2O2（200 μmol/L）诱导IEC-6细胞氧化损伤。同时，通过预处理IEC-6细胞24 h，评价BBE （0～800 μg/mL）的有效水平。不同质量浓度的BBE可显著提高IEC-6细胞的活力（P＜0.001）。然而，当BBE质量浓度超过600 μg/mL时，IEC-6细胞的活力略有下降（图1F）。因此，在进一步的实验中，BBE的质量浓度为0～600 μg/mL。如图1G所示，单独暴露于H2O2后，IEC-6细胞的存活率显著下降至52.96%（P＜0.01）。然而，不同质量浓度的BBE H2O2共孵育后，细胞活力呈剂量依赖性增加。
***：P<0.001，**：P<0.01，*：P<0.05。单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验。下同。图1 BBE的结构表征，包括色谱（A）、紫外光谱（B）、红外光谱（C）和刚果红分析（D），以及H2O2对IEC-6细胞活力的影响（E）、BBE对IEC-6细胞活力的影响（F）和BBE对H2O2诱导的IEC-6细胞活力的影响（G）体质量减轻是IBD结肠炎的主要临床症状。与NC组相比，DSS组小鼠体质量减轻近20%。然而，BBE干预组表现出体质量减轻的减少（图2A）。疾病活动指数（disease activity index，DAI）和结肠长度减少是评估结肠炎程度的常用参数。在本研究中，与对照组（normal control，NC）小鼠相比，DSS处理的小鼠DAI明显增加，结肠长度明显缩短（P＜0.001）（图2B和C）。然而，相对于DSS处理的小鼠，BBE处理的小鼠DAI表现出明显的降低（P＜0.001），结肠长度显著增加（P＜0.01）。D-乳酸含量的变化可以作为小鼠肠通透性对BBE治疗的反应。与NC组相比，DSS组结肠内D-乳酸质量浓度显著升高（P＜0.001），而BBE干预组D-乳酸含量显著降低（P＜0.01）（图2E）。
图2 BBE干预后小鼠体质量（A）、DAI（B）、结肠长度（C）、结肠宏观图片（D）、D-乳酸质量浓度（E）的变化
NC组小鼠结肠组织完整，隐窝正常。无炎症细胞浸润，杯状细胞中黏蛋白含量丰富（图3A和B）。相反，DSS组小鼠结肠隐窝受损，结肠上皮绒毛丢失，炎症细胞浸润，肠黏膜下水肿，结肠黏蛋白大量丢失。然而，BBE给药后，结肠组织结构和损伤症状得到缓解，杯状细胞明显增加（图3D）（P＜0.01）。结肠黏液层成分的减少加重了结肠炎的症状。muc-2的mRNA表达情况如图3E所示，与NC组结肠组织相比，DSS组muc-2表达显著降低（P＜0.01）。
图3 BBE干预对小鼠结肠H&E（A）和AB-PAS（B）染色组织切片、组织病理学评分（C）、杯状细胞数量（D）和muc-2 mRNA表达（E）的影响DSS处理小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显高于NC小鼠（P＜0.05）（图4A、C、D）。然而，BBE干预强烈抑制了结肠组织中细胞因子的上调。此外，DSS处理后结肠组织中IL-10水平也明显降低（图4B）（P＜0.01），但BBE干预明显抑制降低。
图4 BBE干预后结肠炎小鼠结肠组织中IL-6（A）、IL-10（B）、IL-1β（C）、TNF-α（D）水平的变化
与NC组比较，DSS治疗组小鼠结肠ZO-1、Occludin、Claudin-1免疫组化染色图像中几乎没有阳性细胞，同时免疫组化评分显著降低（P＜0.01）（图5）。但BBE干预能够明显减少损害。同样，在紧密连接（tight junctions，TJs）的mRNA表达中也检测到类似的趋势。其中，BBEH（400 mg/mL BBE）干预小鼠结肠Occludin mRNA表达与NC组相似。一般情况下，Claudin-1主要出现在结肠上皮细胞的细胞膜上。BBE干预组Claudin-1 mRNA表达明显高于DSS组（P＜0.01）（图5I）。BBEH的修复效果优于NC组。基于上述3 种蛋白的mRNA表达，BBE可有效修复DSS诱导的小鼠肠上皮屏障损伤。
图5 BBE对上皮屏障的影响，包括TJs的免疫组化染色（A）、免疫组化评分（B）和TJsmRNA表达（C）
氧化应激在结肠炎的发病和发展中起重要作用。因此，我们评估了BBE对DSS处理小鼠氧化失衡的修复作用。经BBE干预后，DSS诱导的低谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、高氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量和低GSH/GSSG比值得到改善（图6A-C）。此外，DSS增加了小鼠结肠中髓过氧物酶（myeloperoxidase，MPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，而BBE干预改善效果明显（P＜0.05）。DSS显著提高了NOS1蛋白含量，降低了抗氧化蛋白NRF2含量（P＜0.001）（图6F）。与NC组相比，DSS组在结肠中表现出NLRP3炎症复合物和凋亡标志物Gasdermin
D（GSDMD）的激活（P＜0.001）（图6F），而BBE干预组明显表现出对NLRP3/GSDMD细胞凋亡的抑制作用,表明BBE阻断了由过度氧化应激引起的各种炎症功能障碍。
图6 BBE对结肠炎小鼠氧化应激的抑制作用。GSH（A）、GSSG（B）、GSH/GSSG（C）、MPO（D）、MDA（E）和SOD（F）的表达水平。通过western
blotting （G）分析NOS1、NRF2、NLPR3和GSDMD的表达情况。将NOS1、NRF2、NLPR3和GSDMD的相对光密度归一化为GADPH（F）
与NC组相比，DSS组结肠中乙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸含量显著下降（表1）（P＜0.05），丙酸和戊酸含量也有所降低。然而，BBE干预组显示出结肠中乙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸水平的明显增加（P＜0.05）。BBEH的改善效果明显强于BBEL（200 mg/mL BBE）。表1 小鼠肠内SCFAs的质量浓度
通过16s rRNA基因测序评估BBE对肠道菌群多样性和结构的影响。如图7A和B所示，与DSS组相比，BBE干预组Shannon和Simpson指数明显增加，但差异不明显（P＞0.05）。根据主成分分析，PC1和PC2分别为36.95%和23.39%（图7C）。在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度发生了显著变化。DSS显著提高了疣微菌门（Verrucomicrobiota）和变形菌门（Proteobacteria）的丰度，降低了Firmicutes和Bacteroidota的丰度。但这些结果在BBE干预后得到改善（图7D）。此外，在属水平上，通过直方图和线性判别分析效应大小分析观察到NC组和BBEH组以及DSS组和BBEH组之间的分类群（图7E和F）。在BBE干预后，厚壁菌属（Firmicutes）、Muribaculaceae、梭菌属（Clostridia）和乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度显著增加。上述结果表明，BBE显著恢复了DSS处理小鼠肠道菌群的变化。
图7 BBE干预后小鼠结肠肠道菌群的变化。Shannon指数（A）、Simpson指数（B）、主成分分析（C）、门水平（D）的比较，以及OTU水平上微生物群中NC和BBEH（F）、DSS和BBEH（G）的线性判别分析效应量（LEfSe）分析
Escherichia-Shigella、Akkermansia、Bacteroides、Lactobacillus、Clostriodia_Ucg-014、Romboutsia、Muribaculaceae、Turicibacter和Alistipes是具有主要相关性的微生物群（图8A）。BBE组肠道微生物变化的相关分析（图8C）显示，Muribaculaceae、Turicibacter、Clostridia_Ucg-014和Lactobacillus的丰度与Escherichia-Shigella的丰度呈负相关。结果表明，BBE可以通过改善益生菌对病原菌的拮抗作用来维持肠道内稳态。对肠道菌群功能的预测（图8B）预示着BBE干预会下调结肠炎小鼠的LPS生物合成和氧化磷酸化。SCFAs受到包括Romboutsia和Turicibacter在内的属的正调控。此外，Muribaculaceae、Prevotellaceae、Lachnospiraceae和Ruminococcus正调节黏液蛋白（muc-2）和TJ蛋白（ZO-1和Occludin），负调节结肠炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）、氧化应激因子（NOS1和GSSG）和细胞焦亡因子（NLPR3和GSDMD）。
图8 BBEH组与DSS组微生物菌群水平分析（A）、肠道菌群功能预测（B）、肠道菌群变化相关分析（C）、前30 名菌群水平生化指标与微生物群多重相关性变化（D）
综上所述，从B. breve H4-2中分离得到的BBE由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖和半乳糖组成，比例为1.00:0.76:1.79:1.03:0.63。BBE含有3.37%的硫酸盐基团，具有立体螺旋结构。BBE能有效修复H2O2诱导的IEC-6细胞损伤。BBE还通过抑制氧化应激、修复机械屏障、增加SCFA和抗炎（IL-10）水平、抑制促炎（TNF-α、IL-6、IL-1β）含量和调节肠道微生物群来减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。本研究表明，BBE可以作为一种新兴的抗炎物质用于IBD的治疗。在未来的研究中，我们将结合纯化和光谱分析技术，明确BBE的具体活性成分和结构特征。文章《Exopolysaccharide from Bifidobacterium breve alleviate dextran sulfate sodium-induced colitis in mice via inhibiting oxidative stress and regulating intestinal flora》发表于Food Bioscience 2023年56卷文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2212429223006715
孟祥晨，东北农业大学乳品科学教育部重点实验室/食品学院教授、博士生导师，食品发酵工程二级学科带头人，乳品科学教育部重点实验室乳品微生物及生物技术平台首席专家。爱尔兰UCC大学访问学者，美国犹他州立大学高级访问学者。中国畜产品加工研究会常务理事；国家食品药品监督管理局食品安全专家；中国奶业协会理事；农业部农产品加工标准化技术委员会委员。主要从事乳品科学与技术，食品微生物与生物技术，食品发酵等领域的教学和科研工作。先后主持、参加国家自然科学基金、教育部创新团队、“863”项目、国家科技支撑、省市各类课题20 余项，获各级各类奖励8项。获授权专利10 余项，转让科技成果2 项。出版专著和教材10 余部，发表学术论文200 余篇。
新刊启动| Food Science of Animal Products《动物源食品科学》（英文），欢迎投稿
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN: 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
