近年来，随着基因工程技术的迭代更替，小麦 (Triticum
aestivum L.) 生物育种技术也在不断地创新和发展，这给小麦遗传学、基因组学和分子育种研究带来了革命性的发展。以CRISPR/Cas9系统及其衍生工具 (碱基编辑器等) 为主的基因组编辑工具由于其简易、高效和精准的特性，极大地加速了小麦优异性状控制基因功能的解析及定向分子育种的研究。然而CRISPR/Cas9系统及其衍生工具的应用受限于5¢-NGG-3¢PAM (原间隔基序) 偏好的限制，尤其是在基因组庞大且复杂的麦类作物中。区别于CRISPR/Cas9系统，源于Type V的CRISPR/CasΦ2系统偏好识别5¢-TBN-3¢PAM，而且CasΦ2体积较小 (仅为Cas9的一半)，对目标DNA的切割会产生粘性末端，产生DNA的缺失 (Pausch et al.,
2020)。虽然前人发现CRISPR/CasΦ2可在拟南芥等植物中进行基因组编辑，但效率偏低。基于CRISPR/CasΦ2的单碱基编辑工具尚待开发，且该系统是否可用于麦类作物基因组编辑尚无研究报道。近日，河南农业大学/河南大学合作在JIPB上发表了题为“CRISPR/CasΦ2-mediated gene editing in wheat and rye”的研究论文 (https://doi.org/10.1111/jipb.13624)。该研究在小麦和黑麦中建立起了CRISPR/CasΦ2系统介导的基因敲除和单碱基编辑工具。通过驱动crRNA精准切割、组装不同核定位信号和优化CasΦ2蛋白，可将CRISPR/CasΦ2编辑系统敲除效率从本底水平提升至30% (突变体创制)，而且发现通过设计对向双靶点策略可进一步提高该系统的敲除效率。通过构建失活的CasΦ2蛋白dCasΦ2，开发了胞嘧啶碱基编辑器dCasΦ2-cytosine base editor (dCasΦ2-CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 dCasΦ2-adenine
base editor (dCasΦ2-ABE)，在小麦和黑麦中实现了高效的单碱基编辑，C-to-T和A-to-G的编辑范围分别为C2至C17位和A9至A11位。脱靶效应分析表明CRISPR/CasΦ2介导的基因敲除和单碱基编辑具有高特异性。这些研究结果增加了对小型、高效和特异的CRISPR/CasΦ2系统介导植物基因组编辑功能的认识，对未来进一步改进和利用该系统进行作物基因组精准修饰，尤其是促进麦类作物基因组工程研究的发展，具有重要意义和价值。图1. CRISPR/CasΦ2介导的基因敲除和单碱基编辑系统工具河南农业大学博士研究生赵三增、韩雪莹和硕士研究生朱亚晨为论文共同第一作者，河南农业大学姬祥教授、王道文研究员和河南大学司小敏教授为论文通讯作者，河南农业大学刘会云副教授、陈震教授等也参与了研究工作。该研究得到国家重点研发计划 (2021YFF1000022)、国家自然科学基金 (32370432和32000286) 等项目的资助。Pausch, P., Al-Shayeb, B., Bisom-Rapp, E., Tsuchida, C.A.,
Li, Z., Cress, B.F., Knott, G.J., Jacobsen, S.E., Banfield, J.F. and Doudna,
J.A. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369: 333-337.
文章引用：
Zhao, S., Han, X., Zhu, Y., Han, Y., Liu, H., Chen, Z., Li, H., Wang,
D., Tian, C., Yuan, Y., Guo, Y., Si, X., Wang, D. and Ji, X. (2024).
CRISPR/CasΦ2-mediated gene editing in wheat and rye. J. Integr. Plant Biol. https://doi.org/10.1111/jipb.13624.
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